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技术优势

天然构象解析

在接近天然、完全水合的状态下,解析可溶性蛋白、膜蛋白及大型蛋白复合物的多构象三维结构

样本无需结晶

无需对样品进行结晶,直接制备冷冻玻璃态样本即可上机

极少的样品需求

一般仅需100ul,浓度2mg/mL,纯度>95%的蛋白样品

应用场景

生命基本过程

病毒

药物发现

病原体

癌症

罕见病

复杂疾病

发育与健康

关于Cryo-EM SPA

技术介绍

冷冻电镜,是基于电子显微镜的超低温冷冻制样及转移技术(Cryo-EM),可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品,如生物样品、高分子材料等。2017年冷冻电镜技术获得了诺贝尔化学奖,是目前生物医药领域最先进、最具潜力、临床前药物开发应用前景最广阔的技术。水木未来团队对该技术的研究和运用处于世界领先地位,并致力于推动该技术为新药研发产业所用。
单颗粒分析(Single Particle Analysis,SPA)是一组相关的计算机图像处理技术,用于分析在透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)上采集的图像。开发这些方法是为了改善和扩展从颗粒样品(通常是蛋白质或其他大型生物实体,例如病毒)的TEM图像中获得结构生物学信息的能力。
近年来,单颗粒分析技术成为结构生物学众多结构解析方法中异军突起的一支。截至2021年1月27日EMDB中共有三维密度图数量13827个(6854个包含PDB数据),其中80%的三维密度图是用SPA技术解析的。(点击查看最新的数据)https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/statistics_emmethod.html/


Distribution of released maps(13827 in total)as a function of technique used



图1  EMDB数据库中不同技术解析电镜结构的占比

平台展示

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图3 冷冻电镜中心操作台掠影

Cryo-EM SPA应用案例

案例一:

2018年4月26日水木未来联合创始人、清华大学生命科学学院院长王宏伟及其团队发表在Cell上的“Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate”通过单颗粒重构技术获得了apo-hDicer-TRBP复合体的高分辨率三维结构 (4.4 Å),首次解析了人源Dicer的高分辨率整体结构,确定了Dicer蛋白中各结构域的精确三维分布及结构域之间的空间关系[1]






图4 人源Dicer-TRBP复合体识别和处理具有不同结构的pre-miRNAs,并将其加工成具有相同特征的产物

案例二:

2020年12月28日,施一公教授团队发表在Cell上的文章“Structural Basis of γ-Secretase Inhibition and Modulation by Small Molecule Drugs”第一次报道了γ-分泌酶结合三种小分子抑制(Semagacestat、Avagacestat和L685,458)和一种调节剂(E2012)的四个原子分辨率冷冻电镜结构,阐明了γ-分泌酶识别不同种类抑制剂及调节剂的分子机理。研究首次完整展现了γ-分泌酶结合底物与药物的全过程,为了解γ-分泌酶活性调节机制提供了前所未有的精准蓝图,也将极大地推进下一代γ-分泌酶抑制剂及调节剂的设计与优化[2]



图5 γ-分泌酶结合三种小分子抑制剂(Semagacestat、Avagacestat和L685,458)和一种调节剂(E2012)的原子分辨率冷冻电镜结构



案例三:

2019年4月5日水木未来联合创始人、清华大学生命科学学院院长王宏伟及其团队联合清华大学柴继杰团队、中国科学院遗传与发育生物学研究所周俭民团队背靠背发表在Science上的“Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex”和“Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity”两篇文章发现由抗病蛋白组成的抗病小体并解析了其处于抑制状态、中间状态及五聚体活化状态的冷冻电镜结构,从而揭示了抗病蛋白管控和激活的核心分子机制[3-4]



图6 植物抗病蛋白的抑制状态结构(A)、识别-启动状态结构(B)和启动机理(C)示意图





图7 植物抗病小体不同视角的结构示意图


参考文献:

  1. Liu Z,Wang J,Cheng , et al. Cryo-EM structure of human Dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate[J]. Cell, 2018.
  2. Yang G, Zhou R, Guo X,et al. Structural Basis of γ-Secretase Inhibition and Modulation by Small Molecule Drugs[J]. Cell, 2020.
  3. Wang J , Wang J , Hu M , et al. Ligand-triggered allosteric ADP release primes a plant NLR complex[J]. Science, 2019.
  4. Wang J , Hu M , Wang J , et al. Reconstitution and structure of a plant NLR resistosome conferring immunity[J]. Science, 2019.




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