发布日期：2022-09-08
CD73抗体入选AACR“TOP12”，冷冻电镜空间表位为best in class提供实锤
CD73抗体入选AACR“TOP12”，冷冻电镜空间表位为best in class提供实锤
发布日期：2022-05-31 10:12
水木未来利用冷冻电镜单颗粒分析技术，解析CD73二聚体和全长抗体复合物三维构象，根据空间表位信息阐明抗体非竞争性作用机制，直观“看”到其与同类抗体间的差异，为临床试验亮眼疗效数据提供底层证据支撑。
引言
今年5月Nature Review Drug Discovery发表综述“FDA approves 100th monoclonal antibody product”[1]，从近十年药物获批数量看，抗体药开发几乎省略了从0到1的过程，直接进入爆发式增长。快速增长的市场也催生了一个靶点对应数个甚至数十个在研/临床药物的白热化竞争局面，倒逼药企逐新求异，但随着临床试验对照组设置越为严苛、临床价值具备一票否决权的当下，创新和差异同样意味巨大的风险。
如何在抗体药物研发早期掌握更多信息，夯实证据链以降低临床实验失败风险？如何在体内外试验验证有效的基础上，追根溯源药物的作用机制？如何在标榜技术平台创新的同时，用最直观的证据“看”到创新后产物的实际差异？基于结构的空间表位信息或可提供答案。
目前尚无获批的CD73上市药物，今年AACR上CD73一款抗体入选“Top 12”研究[2]，水木未来有幸承担了该抗体药物的结构解析工作。本文将借此项目管中窥豹，利用其独特的抗原抗体结合模式解释抗体有效避免hook effect的原因，并延展至基于Cryo-EM技术的空间表位鉴定如何赋能差异化抗体研发。
CD73：抗肿瘤药物开发新星靶点
以PD-1、CTLA-4为代表的免疫检测点抑制剂在泛癌种治疗中展现出“长拖尾”的总生存期优势[3]，并逐渐从晚期肿瘤治疗向早期辅助/新辅助治疗延展[4]，但响应率低的问题仍然是临床应用的一大阻力[5]。未满足的临床需求和利益驱动双重因素作用下，药企埋头苦寻免疫治疗新靶点的行为就不难理解。除了新抗原数量等肿瘤自身原因外，宿主原因尤其是肿瘤局部免疫微环境状态与免疫治疗疗效密切相关，如何解除肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用，让冷肿瘤变热成为提高治疗效应率、克服免疫治疗耐药的一大策略[6]。
肿瘤抑制性免疫微环境形成的重要机制之一是腺苷生成通路的活化，三磷酸腺苷ATP和腺苷ADO同为调节肿瘤细胞生长和免疫细胞状态的信号，但是不同于ATP的促炎作用，其代谢产物ADO可以激活G蛋白偶联受体A2A和A2B，通过抑制T细胞的增殖和细胞毒作用、阻断树突状细胞的分化成熟等方式，使肿瘤微环境中的免疫细胞处于低应答状态（Figure 1），也基于此，降腺苷成为抗肿瘤药物开发的重要思路[7]。
ADO在体内的生成途径之一，是ATP经过胞外核苷酸酶CD39和CD73依次水解后生成ADO（Figure 2，红线标记部分），开发针对CD73的抑制性小分子或抗体类药物，可以阻断ATP向ADO的转化[8]。
Figure 1. 腺苷的生成及相关信号通路[7]
CD73又称胞外5’-核苷酸酶（Ecto-5’-Nucleotidase），在ATP被CD39催化生成单磷酸腺苷AMP后，CD73负责进一步将AMP脱磷酸生成ADO。CD73在体内以非共价二聚体形式存在，CD73单体的N端结构域和C端结构域之间由一个短α螺旋连接，结构生物学研究早在2012年就捕捉到了CD73差异明显的两种构象状态——开放构象和闭合构象，两种状态下N端和C端结构域的相对位移幅度高达114°。N端结构域中的灰色圆球标注了金属锌离子结合位置，底物结合位点则位于C端结构域，红色树枝状图案代表配体。C端结构域结合AMP底物后，在闭合状态下，C端和N端结构域靠近，底物和金属离子结合位点共同形成了酶活催化中心，N端/C端结构域靠近后形成的互作界面及空间构象决定了酶对于催化底物单磷酸核苷酸的选择性，两个结构域间较大的转动幅度则有利于水解产物ADO的释放[9]。
Figure 2. 闭合状态下CD73具备催化活性的示意图[10]
CD73治疗性抗体结构研究进展
已公开结构和表位信息的共有4款治疗性抗体（Table 1），虽然Sanofi开发的是靶向CD73不同表位的双抗，但因为主要通过TB19发挥抑制作用，且结合表位更具特殊性，因此仅对TB19进行分析。
Table 1. 公开结构和表位信息的CD73治疗性抗体
1. MEDI9447（又名Oleclumab）
研发较早，也是颇受关注的一款抗体药。利用氢氘交换、位点突变等技术推测MEDI9947结合于CD73抗原N端结构域的顶端、靠外的位置。作为别构抑制剂，抗体的结合并未显著改变CD73蛋白三级结构（Figure 3）。
Figure 3. 利用计算机模拟预测MEDI9447 Fv与CD73的结合方式
（利用CD73二聚体开放构象时的晶体结构进行虚拟对接，玫红色标注了3个最重要的抗原抗体互作氨基酸，粉红色代表次要的3个抗原表位）
根据抗体结合的表位信息和抗原抗体复合物的分子量大小推测，一个抗体的两个Fab分别结合两个CD73二聚体中的其中一个单体，从而将两个CD73二聚体牵在一起（Figure 4），通过限制活化所必须经历的构象变化，达到阻断催化活性的目的。在此种inter-dimer（两个CD73二聚体产生“交联”）的作用模式下，抗体的两个Fab必须同时与CD73的N端产生结合才能发挥抑制酶活的效果，这对于抗体抗原的比例要求极为苛刻。实际临床很难保证体内抗体和抗原的摩尔比为1：1，一旦抗原抗体比例不合适，便会产生抗体药开发时最为担心的钩状效应（hook effect），即当抗原CD73浓度固定时，增加抗体用量反而出现药效下降的情况，而在MEDI9947药物开发和临床实验中也确实观察到hook effect。
Figure 4. intre-dimer结合方式下抗体抑制酶活的机制示意图[11]
2. IPH5301
虽然解析的结构是IPH5301抗体单个Fab与CD73结合的复合物状态，但是结合全长抗体与CD73形成的复合物的负染结果和Fab-CD73复合物结构中Fab的朝向，可以推测出抗体作用机制，即全长抗体的两个Fab分别结合同一个CD73二聚体中的两个单体，因为抗体的Y型构象限制（两个Fab的恒定区被Fc拉到一起），抗体结合后将二聚体的两个N端牵起并固定在介于Open和Closed之间的中间态。这一模型也通过体外Fab抑制酶活试验进行了验证——仅靠加入Fab并不能抑制CD73催化活性，提示全长抗体Y型构象对CD73活性抑制的重要性。因为一个抗体的两个Fab需要同时结合在同一个二聚体的两个单体上，因此又被称作intra-dimer结合方式。虽然不同于MEDI9447的inter-dimer结合方式，但从作用模型推测，如果抗体相对CD73二聚体过量，很可能抗体仅有1个Fab结合CD73单体，这样对于CD73二聚体两个N端的牵制作用消失，同样可能会有hook effect的风险。
Figure 5. IPH5301 Fab和CD73复合物结构
（A：CD73-IPH5301全长抗体复合物负染代表性构象，绿色框代表CD73的N端结构域，黄色代表C端结构域，青蓝色代表IPH5301的Fab，黑色代表IPH5301的Fc；B：CD73和IPH5301 Fab复合物高分辨率结构；C：左侧是模拟CD73开放状态下抗体Fab的结合情况，右侧是推测的结合方式，即抗体利用Y型构象将CD73固定在介于Open和Closed间的中间态，N端和C端无法闭合形成催化中心）
3. TB19
TB19同样结合在CD73单体的N端，但是抗原表位明显不同于上述两个抗体，虽然结合Fab后CD73单体两个结构域之间的角度也是处于Open和Closed之间的中间状态，但作用机制却完全不同。TB19结合状态下，与锌离子作用的His220氨基酸残基相比Closed构象和Open构象，其位置分别移动了约22 Å和27 Å（Figure 6A），证明N端和C端被“锁”在了非活化的中间态，但是C端底物结合区和N端离子结合区两者空间位置无法靠近，并非因为Y型抗体的立体构象限制了两个Fab张开的角度，而是因为所结合的Fab占据了活性闭合状态下N端结构域的位置（Figure 6B）。此种作用机制下，TB19对CD73的抑制效果无需依赖特定的二价结合模式，理论上降低了hook effect发生概率。但TB19作为单克隆抗体，其与CD73的亲和力并不高，仅在亚微摩尔浓度时才具备较强的抑制活性，因此TB19被作为改造双特异性抗体的母体，与其他抗体配合以达到协同增效的目的。
Figure 6. CD73二聚体及单体分别与TB19 Fv结合后的空间构象
（A：TB19结合后N端和C端处于Open和Closed的中间状态，锌离子结合位置远离底物结合位置；B：拟合已发表的Closed构象确定TB19与Closed构象下N端结构域存在空间位阻）
项目案例结构剖析
前面提到的抗体要么必须在全长情况下才能发挥酶活抑制作用，要么作为单抗效果不佳需要改造成双抗增效，而本项目研究的单抗即便Fab单价结合也可发挥同等效力，并不依赖抗体的Y型结构，暗示其作用机制可能与前文提到的抗体均有所不同。
作为目前唯一一个结合在CD73蛋白C端结构域的抗体，抗体结合位置很特殊，位于C端结构域形成二聚体的界面的外缘，虽然与底物结合位点相距较近，但并不会阻碍底物与CD73的结合（Figure 7A）。表位解析项目首先考虑抗体结合表位和底物结合口袋的位置关系，最常见的抗体作用机制即抗体与底物竞争，但这不仅对抗体抗原亲和性的要求很高，而且底物结合的多样性也为抗体筛选设置了阻碍，更为重要的是，不同酶结合底物的活性区往往存在较高的序列同源性，药物脱靶的潜在风险增加。因此，非底物竞争性结合的抗体通过别构机制，将蛋白构象锁定在失活状态从而发挥酶活抑制的作用，也是抗体药开发的重要思路。
将CD73二聚体与抗体Fab结合的复合物结构，与Open及Closed两种状态下CD73二聚体构象进行对比，可以看出本项目解析得到的CD73二聚体介于Open和Closed两种状态之间的中间构象，且抗体与Closed活性状态下蛋白的N端结构域存在明显位阻，抗体结合后阻碍了底物和离子结合区相互靠近。通过占位将CD73锁定在失活态，此种作用模式下单价结合即可发挥作用，体系内CD73和抗体的比例不会显著影响抗体的抑制效果。而且，抗体结合在CD73蛋白C端结构域的外缘，也意味着更广泛的结合角度和更高的结合概率。结构研究很好地验证并解释了体外亲和力、酶活、hook effect等试验结果。
Figure 7. 抗体结合在CD73蛋白的C端结构域二聚体界面上
（A：CD73的原子结构模型及关键抗原表位（红色标注）；B：最终得到的抗体Fab与CD73二聚体形成的复合物的结构模型；C：抗体和CD73的N端结构域存在空间位阻，将CD73锁定在非激活态）
基于CryoEM技术的空间表位鉴定技术
Cryo-EM高分辨率结构已然成为新冠领域研究论文的标配，而基于空间构象和表位信息更是建立起一整套关于新冠中和性抗体效价评测的体系[14]，但其实空间表位信息对于所有大分子抗体药物的开发而言都是非常关键的核心数据，不仅有助于理解抗体作用机制，分析构效关系，甚至有可能成为抗体专利保护的重要因素。
随着冷冻电镜单颗粒分析技术的发展，越来越多基于冷冻电镜的抗原抗体复合物高分辨结构被发表[15-21]。相比其他结构解析技术，冷冻电镜在药物开发领域的快速普及，不仅在于它能得到生物大分子接近生理状态下的构象，更大的优势体现在：
1）无需结晶，蛋白溶液状态下即可直接制样进行电镜观察和结构解析，对于状态良好的颗粒，结构解析最短可以在一天内完成；
2）所需蛋白总量低至0.1mg，省去了大量表达纯化抗体和抗原的时间及成本；
3）对于膜蛋白、分子量较大的蛋白、有大量糖基化修饰的蛋白等难结晶蛋白而言，Cryo-EM几乎已成为首选的解析手段。
结语
以临床价值为导向是“差异”体现的一个重要方面，在追求临床试验更小p值等表层差异的同时，基于结构的抗体表位信息，不仅可以从底层解释抗体作用机制，提供最直观的“差异化”证据，形成证据链闭环，还可以在临床前研发阶段提前预知差异，甚至在体外生理生化试验基础上，从全新角度评估、预测候选抗体表现，让关键性决策更加理性。
建立在噬菌体展示、杂交瘤筛选等底层技术上的抗体药物研发，已经告别“拆盲盒”时代，希望以冷冻电镜为代表的结构生物学能成为助力抗体药物研发的“慧眼”，帮助广大药企从芸芸抗体中一眼看出最有价值的那一株。
作者：王悦
审稿人：刘传
参考文献
1. Mullard A. FDA approves 100th monoclonal antibody product[J]. Nature reviews. Drug Discovery, 2021.
2. Wang Z, Cao W, Zhang Y, et al. A differentiated CD73 blocking antibody with a unique intra-dimer binding mechanism for cancer immunotherapy[J]. 2021.
3. Garon E B, Hellmann M D, Rizvi N A, et al. Five-year overall survival for patients with advanced non‒small-cell lung cancer treated with pembrolizumab: results from the phase I KEYNOTE-001 study[J]. Journal of Clinical Oncology, 2019, 37(28): 2518.
4. Topalian S L, Taube J M, Pardoll D M. Neoadjuvant checkpoint blockade for cancer immunotherapy[J]. Science, 2020, 367(6477).
5. Schoenfeld A J, Hellmann M D. Acquired resistance to immune checkpoint inhibitors[J]. Cancer Cell, 2020, 37(4): 443-455.
6. Galon J, Bruni D. Approaches to treat immune hot, altered and cold tumours with combination immunotherapies[J]. Nature reviews Drug discovery, 2019, 18(3): 197-218.
7. Vijayan D, Young A, Teng M W L, et al. Targeting immunosuppressive adenosine in cancer[J]. Nature Reviews Cancer, 2017, 17(12): 709-724.
8. Antonioli L, Yegutkin G G, Pacher P, et al. Anti-CD73 in cancer immunotherapy: awakening new opportunities[J]. Trends in cancer, 2016, 2(2): 95-109.
9. Knapp K, Zebisch M, Pippel J, et al. Crystal structure of the human ecto-5′-nucleotidase (CD73): insights into the regulation of purinergic signaling[J]. Structure, 2012, 20(12): 2161-2173.
10. Stefano J E, Lord D M, Zhou Y, et al. A highly potent CD73 biparatopic antibody blocks organization of the enzyme active site through dual mechanisms[J]. Journal of Biological Chemistry, 2020, 295(52): 18379-18389.
11. Geoghegan J C, Diedrich G, Lu X, et al. Inhibition of CD73 AMP hydrolysis by a therapeutic antibody with a dual, non-competitive mechanism of action[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2016, 8(3): 454-467.
12. Perrot I, Michaud H A, Giraudon-Paoli M, et al. Blocking antibodies targeting the CD39/CD73 immunosuppressive pathway unleash immune responses in combination cancer therapies[J]. Cell reports, 2019, 27(8): 2411-2425. e9.
13. Wurm M, Schaaf O, Reutner K, et al. A novel antagonistic CD73 antibody for inhibition of the immunosuppressive adenosine pathway[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2021, 20(11): 2250-2261.
14. Barnes C O, Jette C A, Abernathy M E, et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies[J]. Nature, 2020, 588(7839): 682-687.
15. Diwanji D, Trenker R, Thaker T M, et al. Structures of the HER2–HER3–NRG1β complex reveal a dynamic dimer interface[J]. Nature, 2021: 1-5.
16. Kumar A, Planchais C, Fronzes R, et al. Binding mechanisms of therapeutic antibodies to human CD20[J]. Science, 2020, 369(6505): 793-799.
17. Rougé L, Chiang N, Steffek M, et al. Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab[J]. Science, 2020, 367(6483): 1224-1230.
18. Chin S M, Kimberlin C R, Roe-Zurz Z, et al. Structure of the 4-1BB/4-1BBL complex and distinct binding and functional properties of utomilumab and urelumab[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 1-13.
19. Neijssen J, Cardoso R M F, Chevalier K M, et al. Discovery of amivantamab (JNJ-61186372), a bispecific antibody targeting EGFR and MET[J]. Journal of Biological Chemistry, 2021, 296.
20. Zhang H, Huang C S, Yu X, et al. Cryo-EM structure of ABCG5/G8 in complex with modulating antibodies[J]. Communications biology, 2021, 4(1): 1-9.
21. Hao Y, Yu X, Bai Y, et al. Cryo-EM Structure of HER2-trastuzumab-pertuzumab complex[J]. Plos one, 2019, 14(5): e0216095.
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