发布日期：2022-05-31
水木视界iss.3丨基于冷冻电镜和次世代测序技术的抗体发现
水木视界iss.3丨基于冷冻电镜和次世代测序技术的抗体发现
发布日期：2022-05-31 11:57
斯克里普斯研究所的科学家们设计了一种具有大幅缩短现代疫苗开发流程潜力的方法，并展示了他们如何应用高分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）数据来快速在原子水平上表征由疫苗或感染引起且与选定的病毒靶点相结合的抗体。该方法利用一种 "从结构到序列"的计算机算法，可以将冷冻电镜确定的单克隆抗体（mAb）结构与产生该结构的DNA序列联系起来。
该研究的通讯作者、斯克里普斯研究所的结构和计算生物学系教授Andrew Ward博士提到："COVID-19的大流行突出了对高效快速的疫苗和抗病毒技术的需求。我们乐观地认为，这种新方法将通过极大缩短抗体的发现流程来帮助我们满足这一需求。"
Andrew Ward和他的同事们在《Science Advances》上的 "从结构到序列，基于冷冻电镜的抗体发现"一文中描述了他们的技术。(DOI: 10.1126/sciadv.abk2039)
文章作者们指出，单克隆抗体的分离和定性是对疫苗或感染的免疫反应分析中的一大痛点。"显著降低传统抗体分离方法效率的步骤之一是筛选mAb库，以确定具有所需表位特异性的克隆......对感染或疫苗接种的免疫反应进行综合分析是极其费力且昂贵的。" 正如该研究的共同第一作者Aleksandar Antanasijevic博士所提到的："一般来说，识别对病毒有用的抗体需要对产生抗体的B细胞进行费力的分类和测试，以找到正确的抗体。这一过程往往需要数月时间。"
单克隆抗体的释放
研究人员的部分成果归功于最近冷冻电镜的改进，这种技术使用电子束来标记目标并成像，其结果准确度远高于普通光学显微镜。例如，在8月发表于《Nature Communications》上的一项研究中，研究人员使用高分辨率冷冻电镜快速而精确地绘制了猕猴的抗体与HIV包膜蛋白的合成版本结合的位置，这些合成版本正在被开发并用于潜在的HIV疫苗。他们写道："最近，我们开发了一种方法（cryoEMPEM），即使用冷冻电镜（cryoEM）在免疫血清的水平上表征由疫苗接种或感染引起的多克隆抗体（pAb）反应。
在研究中，研究者们将这一研究思路向前推进了一步。他们采用了一种 "从结构到序列"的计算机算法，该算法可以将冷冻电镜确定的抗体结构与产生该结构的DNA序列联系起来。他们写道："在这项研究中，我们通过引入一种从结构观察中识别功能性抗体序列的方法，扩大了冷冻电镜数据的适用性。"
为了实现这一点，研究小组建立了一个含有猕猴的所有抗体编码的DNA序列数据库，该数据库可以通过快速对动物淋巴结中产生抗体的B细胞的遗传物质进行批量测序而获得。将该算法应用于冷冻电镜数据和抗体序列库后，科学家们便能将冷冻电镜图像中的选定抗体与序列数据库中定义的独特抗体进行高准确度匹配。
研究小组表示，他们可以通过使用序列数据制作一个单克隆抗体的副本来确认结果的准确性，并通过冷冻电镜验证该抗体与最初成像的抗体以相同的方式结合。"......我们开发了一种直接从冷冻电镜图像中确定mAb序列的方法，"该团队说。"这种由电子显微镜（EM）和次世代测序（NGS）组成的复合方法使多克隆Fabs（Fv）可变区域的序列分配成为可能，包括互补性决定区域（CDRs）......这种方法为基于单个B细胞分选、杂交瘤和噬菌体展示技术的传统mAb发现方法提供了一种替代方法。"
斯克里普斯研究所科学家和研究的共同第一作者Charles Bowman博士说。"有了这种新方法，我们只需10天左右便能从病人的血样中采集到所有由感染及免疫引发的目标抗体"
文章作者们还指出，在文中概念的验证过程中，他们使用了对某种特定抗原具有特异性的淋巴结B细胞。然而，他们推测这种方法也适用于从其他来源获得的B细胞，如外周血、脾脏、骨髓或浆细胞，并且无需为抗原结合进行预选。对此，他们表示："通过使用冷冻电镜直接对血清抗体进行成像的方法，我们有了丰度、亲和力和克隆性的指标。
科学家们现在正在完善他们的技术，以优化其效率和可用性，以期将其应用于以下几个领域：快速评估人类对实验性HIV疫苗的抗体反应；为自身免疫性疾病开发抗体阻断疗法；以及发现可以治疗性地击中细胞上其他蛋白质靶点的抗体。
斯克里普斯研究所开发的一种新方法：利用冷冻电镜技术快速识别用于疫苗开发的抗体。在这个例子中，该算法从数据库中筛选了大约100,000到1,000,000个可能的抗体序列，以确定与他们的冷冻电镜图像（透明的灰色表面）中观察到的抗体最匹配的序列（左边）。[斯克里普斯研究所]
研究者们预测：在未来，冷冻电镜技术和"从结构到序列"的算法改进将允许我们更快速地识别抗体：只需依靠高分辨率的冷冻电镜结构图像，而不需要对B细胞进行DNA测序。
Antanasijevic说："这种从结构到序列的算法在免疫学和其他领域有很大的潜力。"我们设想有一天能够用它来研究蛋白质之间的相互作用，例如，发现某个蛋白质的结合配体"。正如作者所总结的那样，"......我们的方法将为发现毫安抗体和分析感染和疫苗接种的抗体反应打开新的大门。目前的COVID-19大流行便突出了对这种高效且快速的技术的需求"。
支持性内容
相关Science文章:
"From structure to sequence: Antibody discovery using cryoEM"
在分析对疫苗或感染的免疫反应时，其中一个限制性步骤是对单克隆抗体的分离和定性。在这里，我们提出了一种融合了结构生物学和生物信息学的方法，直接分配重链和轻链，确定互补性决定的区域，并从血清衍生的多克隆抗体与抗原结合的低温电镜密度图中发现序列。当与下一代免疫测序相结合时，我们能够特异性地识别克隆家族成员，合成单克隆抗体，并确认它们与抗原的互动方式与相应的多克隆抗体相当。这种从多克隆血清中鉴定单克隆抗体的基于结构的方法为分析免疫反应和迭代疫苗设计开辟了新途径。
用于抗体序列测定的方法说明
水木视界丨iss. 3
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